《自然·癌症》：CD4阳性CAR-T细胞抗癌机制大揭秘，通过产生干扰素-γ大面积远距离杀死肿瘤细胞
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我们知道，嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）疗法对B细胞恶性肿瘤的治疗效果很好，通常情况下，CAR-T细胞以CD8 T细胞为主，这是因为CD8 T细胞作为细胞毒性T细胞，对肿瘤的杀伤力更强。
但近年来也有不少研究发现，原本作为辅助T细胞的CD4 T细胞也挺厉害，尤其是在一些临床前肿瘤模型中，CD4 CAR-T（CAR4-T）细胞的抗肿瘤能力甚至超过了CD8 CAR-T（CAR8-T）细胞。
有研究指出，与CD8 T细胞一样，CD4 T细胞也是和肿瘤“贴贴”，利用细胞毒性（释放颗粒酶/穿孔素）直接杀伤肿瘤细胞，还有些研究持反对观点。总之，CD4 T细胞和CAR4-T细胞到底是如何精准杀死肿瘤细胞的还有待进一步确定。
近期，巴斯德研究所的Philippe Bousso团队就通过骨髓活体成像揭示了CAR4-T细胞的抗肿瘤机制。他们发现，CAR4-T细胞的抗肿瘤能力并不依赖于细胞毒性，而是通过产生干扰素-γ（IFN-γ），大面积、远距离地间接作用于肿瘤细胞，选择性地杀死对IFN-γ诱导的凋亡敏感的肿瘤。也就是说，肿瘤细胞对IFN-γ的敏感性，是决定CAR4-T细胞治疗效果的关键。
研究发表在《自然·癌症》上。
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根据既往研究，CAR4-T细胞在治疗不同类型的B细胞恶性肿瘤时，效果差异很大。在本研究中，研究人员同样观察到，在Eμ-myc B细胞淋巴瘤小鼠模型中，CAR4-T细胞表现差强人意，但在B细胞急性淋巴细胞白血病小鼠模型中，CAR4-T细胞能明显地降低骨髓和血液中的肿瘤负荷。
通过骨髓的活体成像和流式细胞术，研究人员进一步发现，经CAR4-T治疗后，B细胞急性淋巴细胞白血病小鼠模型中，凋亡相关蛋白Caspase 3活跃度非常高，而在Eμ-myc B小鼠模型中并未观察到这一现象。这说明CAR4-T细胞是通过促进肿瘤凋亡的方式实现抗肿瘤的目的，且抗肿瘤的能力受到肿瘤类型的影响。
两种B细胞恶性肿瘤的凋亡情况
鉴于T细胞产生的IFN-γ是导致肿瘤细胞凋亡的关键，研究人员想知道CAR4-T细胞是否也是通过产生IFN-γ杀死肿瘤细胞的，于是使用了缺少IFN-γ（IFN-γ−/− ）的CAR4-T细胞治疗B细胞急性淋巴细胞白血病小鼠。
结果发现，与未经处理（WT）的CAR4-T细胞相比，IFN-γ−/− CAR4-T细胞的抗肿瘤能力和诱导肿瘤凋亡的能力都大大降低。
接下来，研究人员通过标记肿瘤凋亡事件，将其分类为与CAR4-T细胞有直接接触的直接杀伤事件，以及与CAR4-T细胞无直接接触的间接杀伤事件。在接受WT CAR4-T细胞治疗的小鼠中，仅有1/3的肿瘤细胞死于直接杀伤事件，绝大部分肿瘤细胞都死在了离CAR4-T细胞比较远地方，当使用IFN-γ−/−CAR4-T细胞治疗后，这种现象几乎消失了。
接受CAR4 T细胞治疗后的凋亡事件
以上结果说明，CAR4-T细胞的抗肿瘤能力主要是靠产生的IFN-γ远距离间接作用于肿瘤细胞实现的。
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那么具体而言，CAR4-T细胞IFN-γ产能如何，能大范围覆盖肿瘤细胞吗？研究人员对测量了CAR4-T细胞产生的IFN-γ的浓度后发现，在B细胞急性淋巴细胞白血病小鼠模型中，CAR4-T细胞产生的IFN-γ浓度是CAR8-T细胞的30倍以上，骨髓活体成像也验证了IFN-γ在整个肿瘤微环境中广泛存在。
在机制上，研究人员通过体外Transwell迁移实验进一步验证了即使在没有直接接触的情况下，CAR4-T细胞也能有效地杀死肿瘤细胞，而这种效果在使用IFN-γ−/−CAR4-T细胞时会减弱。
也就是说，CAR4-T细胞通过分泌IFN-γ，使IFN-γ在肿瘤微环境中大面积扩散，远距离作用于肿瘤细胞，从而引发肿瘤细胞凋亡。更重要的是，这种远距离杀伤现象也在人体肿瘤细胞中也得到了证实。
Transwell迁移实验示意图
此外，研究人员还发现，不同肿瘤对CAR4-T细胞治疗的敏感性不同，如Eµ-myc B细胞，就对CAR4-T细胞产生的IFN-γ不敏感，即便在IFN-γ存在下也不会发生凋亡。
这种对IFN-γ敏感性的差异也体现在实体瘤中，体外实验显示，CAR4-T细胞产生的IFN-γ可诱导B16黑色素瘤细胞凋亡，但对MC38结肠癌细胞没用。这提示，不同种类的肿瘤对IFN-γ的反应不同。肿瘤细胞对IFN-γ诱导的细胞凋亡的敏感性决定了CAR4-T细胞的抗肿瘤效果。
最后，研究人员分析了63例接受抗CD19 CAR-T细胞治疗的弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者数据，检测了患者血液中CAR4和CAR8-T细胞的比值，以及CAR-T治疗1周后患者的IFN-γ血清浓度。
结果发现，与CAR4和CAR8-T细胞比值较低的患者相比，CAR4和CAR8-T细胞比值高的患者血清中的IFN-γ浓度更高。在CAR4和CAR8-T细胞比值高的患者中，高水平的IFN-γ与患者无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）显著改善有关。
CAR4和CAR8 T细胞比值、IFN-γ浓度对PFS和OS的影响
总之，这项研究揭示了CAR4-T细胞的抗癌机制，并发现肿瘤细胞对IFN-γ的敏感性，是决定CAR4-T细胞治疗效果的关键。这一发现无疑为日后优化CAR-T细胞疗法提供了新的思路。
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参考文献：
[1]Boulch, M., Cazaux, M., Cuffel, A. et al. Tumor-intrinsic sensitivity to the pro-apoptotic effects of IFN-γ is a major determinant of CD4+ CAR T-cell antitumor activity. Nat Cancer (2023).
本文作者 ｜ 张金旭