目录
第 1 章 PROTAC 介导的靶标降解:药物发现的范式改变者?
第 2 章 可降解三元复合物的结构和生物物理基本原理
2.1 简介
2.1.1 靶向蛋白质降解机制的优势
2.1.2 PROTACs的发展历史(2001-2010)
2.1.3基于VHL和CRBN的PROTAC小分子(2010-2015)
2.2三元复合物的结构特征
2.2.1 三元复合物的平衡和定义
2.2.2 PROTAC 三元复合物的结构
2.2.3作为单价分子胶的降解剂
2.2.4 PROTAC和分子胶埋藏的表面积
2.3三元复合物的分析方法
2.3.1我的PROTAC形成三元复合物了吗?
2.3.2 我的三元复合物结合的多紧?
2.3.3 我的三元复合物协同性如何?
2.3.4 我的三元复合体能持续多久?
2.3.5 PROTAC是否诱导细胞中三元复合物的形成?
2.4 结语
2.5 致谢
2.5.1 基金
2.5.2 利益冲突声明
第 1 章 PROTAC 介导的靶标降解:药物发现的范式改变者?
PHILIPP M. CROMM, CRAIG M. CREWS AND HILMAR WEINMANN
药物化学领域中,在扩大重要的、疾病驱动的蛋白的可药用空间和对这些蛋白开发新靶向策略的不懈探索中,小分子诱导蛋白质降解的研究进展是近年来最激奋人心的事情。诱导蛋白质降解并控制其命运,不仅可以靶向激酶,还可以靶向受体蛋白和支架蛋白,受体蛋白和支架蛋白由于缺乏明确的活性位点是众所周知的难成药蛋白【1】。该降解机制的核心是利用细胞天然存在的蛋白质降解机制标记靶蛋白并诱导其泛素蛋白酶体系统识别,通过泛素化靶蛋白和随后的蛋白酶体降解从而调控蛋白质的命运【2,3】。蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC) 劫持了这种降解机制,并招募它来降解疾病驱动的靶蛋白,从而使目标蛋白以蛋白酶体依赖的方式被不可逆地清除。(图 1.1)【4-6】。抑制剂和抗体都通过高亲和力与靶蛋白结合或阻断蛋白质-蛋白质相互作用或激酶活性位点的结合,而PROTAC是一种与传统小分子抑制剂或者生物大分子抗体完全不同的作用模式。诱导靶蛋白降解将以前无法成药的受体蛋白或支架蛋白进行药物治疗,并将与靶蛋白相关的有益细胞的事件联系起来从而扩大成药空间【7】。
图1.1 PROTAC作用机制的模式图。PROTAC将感兴趣蛋白(POI)与E3连接酶连接为一个三元复合物。随后在E2结合酶的介导下,泛素被转移到POI上。多泛素链标记的POI被蛋白酶体识别并降解,同时PROTAC分子被释放并进入下一个循环。
从2001年首次概念验证的研究发表以来,PROTAC 技术作为一种化学生物学方法和新的治疗方式已经相对成熟。迄今为止,PROTAC靶向雄激素受体和雌激素受体的首个临床 I 期试验于 2019 年启动(图1.2)【8】。早期的PROTAC应用的是基于多肽的E3连接酶配体,而这些与不同的靶蛋白配体相连的多肽存在细胞渗透性差、降解效率低等问题。2015年,随着研究者对von Hippel Lindau (VHL) E3连接酶的类药性更高的拟肽类配体的开发【9,10】以及对沙利度胺作用机制的阐明【11】取得突破,为RIPK2/ERRα 12 和 BRD4【13,14】的首个成药性PROTAC铺平了道路。由于这些开创性研究显著加速了该领域的发展,学术界以及产业界对PROTAC诱导蛋白质降解的兴趣大大增加【15】。从那时起,来自学术界和产业界的许多科学研究小组都专注于探索PROTAC技术的优势、机会、局限性和弱点。自2013年PROTAC技术先行者Arvinas®公司成立以来,第二代公司,如C4 Therapeutics®(成立于2015年)和Kymera Therapeutics®(成立于2017年)等陆续成立,以探索小分子诱导蛋白质降解的药物研发潜力。鉴于近来人们对这种治疗方法的追捧,这三家生物技术公司已经与几家大型制药公司达成了数百万美元的合作。几乎每家大型制药公司都已开始评估、布局PROTAC技术,要么与上述生物技术公司合作,要么建立自己的蛋白质降解团队,例如诺华®、阿斯利康®或葛兰素史克®等大型制药公司。2019年,Arvinas®启动了分别针对转移性去势抵抗前列腺癌(mCRPC)和转移性ER阳性/HER2阴性乳腺癌中雄激素和雌激素受体的口服小分子蛋白降解剂的I期临床试验。图1.2 PROTAC技术在科学界与产业界的发展时间图以及重要里程碑事件。
尽管第一批公司已经开始生产口服的PROTAC药物,但是该领域的其他新手也开始认识到,PROTAC的设计和优化并不是一个简单直接的过程(图 1.3A)【16】。虽然在大多数情况下将两个类似药物的小分子用一个连接子连接起来能够在细胞培养时产生可降解靶蛋白的化合物,但这些化合物的物理化学特性远远超出了Lipinski类药五规则,使提升PROTAC药物的口服生物利用度具有挑战性【17】。在 PROTAC药物的优化过程中,需对 E3 连接酶配体、连接子和靶蛋白配体都进行设计和优化【18】。为了获得诱导降解最有效的PROTAC,应考虑到不同的E3连接酶以及连接子的组成。连接子的结构和长度起着关键作用,因为连接子可以影响蛋白质的整体构象、结合方向以及三元复合物的形成【19】。因此,连接子的作用远超仅仅连接两个配体;它直接影响PROTAC分子的活性、选择性和物理化学性质【20】。目前为止,已经成功地利用了PROTAC三元复合物的X衍射共晶结构和在缺乏X射线结构数据的情况下基于计算方法预测三元复合物结构模型支持基于结构的优化工作【19,21,22】。尽管连接子设计的化学空间可能很大,但大多数研究小组倾向于以烷基或聚乙二醇(PEG)链作为起点来确定最佳连接子长度。通过选择烷基或PEG连接子,整体物理化学性质(例如拓扑极性表面积TPSA和亲油性cLog P)也被相应修改。刚性基团(例如杂环系统、炔类)也已应用于一些研究中【23,24】。为了快速确定 PROTAC 的最佳连接子长度,构建一个由各种连接子化合物、长度和不同 E3 连接酶配体组成的系统性PROTAC 库对于加速PROTAC药物开发具有很高的价值。最近使用 BRD4 PROTACs 作为模型系统描述了点击化学在制备这种 PROTACs 库中的应用,以快速确定进一步优化的起点【25】。此外,链接子也可以进一步开发作为靶向目标的连接方式,如首个将PROTAC直接递送到目标组织的PROTAC-抗体偶联物已经被报道【26】。图1.3 PROTAC组成图示。(A)PROTAC由一个靶蛋白配体,一个连接子和一个E3连接酶配体组成。图中列举了有代表性的靶蛋白(左侧)和E3连接酶(右侧)的名称。(B)基于VHL降解FAK的PROTAC的结构示意图【7】。不同PROTAC的组成部分用不同颜色表示。
虽然BRD4【27】、雄激素受体或BTK等目前文献报道最多的靶点,但几乎每天都有文献报道新的由PROTAC介导降解的靶蛋白。大多数PROTAC靶点和对应E3连接酶的研究可在表1.1中按时间顺序找到。对于大多数蛋白靶点,PROTAC介导的降解显示出与传统靶向抑制类似的效果,但是PROTAC在解决某些耐药机制或者治疗效果方面优于抑制剂【28】。比如,对于粘着斑激酶(FAK)这样的具有支架功能的蛋白,PROTAC诱导的靶向降解能够关闭FAK的支架功能,这是FAK小分子抑制剂无法实现的(图1.3B)【7】。SMARCA2/4是一个难以靶向的BAF复合体的一部分,靶向降解SMARCA2/4可以实现对复合物功能的摧毁【22】。此外,诱导降解Tau蛋白可清除来自额颞叶痴呆(FTD)患者的神经细胞模型中积聚的蛋白质,这一研究将PROTAC的治疗范围扩大到神经退行性疾病【29】。类似的研究表明,PROTACs在扩大可药用空间方面具有巨大潜力。PROTAC诱导的蛋白质降解解决成药困难的重大疾病的应用将带给我们更多惊喜。近年来,小分子诱导的蛋白质降解引起了人们的极大兴趣,许多工业界和学术界人士都加入了寻求下一个重大药物发现的行列。虽然最初很少有药物化学家认为其可行,但目前两个PROTAC临床候选药物可以口服利用并表现出良好的人体PK特性。也有报道称已开发出新的口服PROTACs,鉴于“超越成药5规则”的临床研究案例的成功,长期以来信奉的“成药5规则”在某些情况下已不适用【17,80,81】。尽管该技术迄今已取得巨大成功,但其全部潜力尚未得到充分发掘,仍然存在许多未知。可以理解的是,在项目选择方面,大多数公司甚至学术研究都避免承担巨大风险。大多数PROTAC靶点是临床验证和已上市的药物。如上所述,在这些情况下,PROTAC的表现明显优于目前已有的抑制剂,但很少触及传统的、基于占位模式无法触及的差异生物学方面【4】。只有在涉及受体蛋白和支架蛋白时,抑制剂因为它们的传统作用模式而无效,PROTACs的全部潜力才会释放出来。然而,要实现这一目标的障碍是为这些不可成药靶蛋白开发合适的配体,这是几十年来药物发现一直面临的难题。然而,将药理获益与单纯的位点结合和随后的靶蛋白降解(事件驱动)正相关而不是与靶向抑制相联系有利于克服此障碍。我们将拭目以待该领域朝着真正的不可成药的蛋白质组方向发展,并帮助识别、验证、消除和靶向新蛋白靶点。
表1.1通过PROTAC泛素化降解的蛋白质
目前为止,蛋白质降解主要集中而在神经退行性疾病、炎症、免疫学(IRAK4和 RIPK2)中也有一些进展【12,29,63】。鉴于许多与癌症诊断相关的预后普遍较差,巨大的医疗需求以及相对较高的耐受性,从治疗领域入手进行药物研发是合理的选择。将适应症范围扩大到包括非恶性疾病在内的其他治疗领域本身就是一个挑战。此外,不仅离子通道和 G 蛋白偶联受体(GPCR)与核转录因子激素受体或激酶的靶向空间不同, E3连接酶的成药性也必须经受更仔细的检视。当涉及到 PROTACs 的适应症扩展时,PROTAC分子调节肿瘤抑制因子如 VHL 或原癌靶点CRBN的活性可能不是一种选择【11,82-84】。凋亡抑制蛋白(IAPs)可能是 VHL 和 CRBN 的替补,并且已经被多次用于诱导多种靶蛋白的降解。然而,向其他治疗适应症的扩展将增加有效靶向降解的新的E3连接酶的需求。特别是找到一个组织特异性或疾病特异性的E3连接酶的价值不可估量。虽然最近发表了第一份研究性论文,但是细胞外蛋白、膜蛋白如离子通道和 GPCR 仍然无法被小分子诱导降解【88】。受到 PROTACs 的启发,将来,人为诱导的新的蛋白质间相互作用领域将会有令人期待的进展【89】。通过招募磷酸酶诱导特定的激酶去磷酸化,已经初步显现出该领域的无限可能【90】。此外,Arvinas 和拜耳公司最近成立的合资企业 Oerth Bio 正在试图利用 PROTAC 技术开发新产品,这代表了靶向蛋白质降解极具潜力的应用前景。虽然还有许多变革即将发生、许多困难需要克服,但是初步成功案例为PROTACs的光明未来点燃了希望,不仅作为化学生物学和药物发现工具箱中的一个新工具,而且代表了一种成功的治疗模式。处于一项如此强大的试图引领药物发现新时代的技术前沿,当然让人感到兴奋。这本书将提供一个关于小分子诱导蛋白质降解领域的最新发展概述。学术界和产业界的贡献者们将从所有可用的角度提供该领域的见解。第 2 章可降解三元复合物的结构和生物物理基本原理
DAVID ZOLLMAN AND ALESSIO CIULLI
2.1 简介
2.1.1 靶向蛋白质降解机制的优势
许多生物学工具被广泛用于研究蛋白质功能,如基因敲除或RNA敲减。基于此类研究的细胞表型通常用于推断特定基因和蛋白质是否参与了疾病相关通路,从而确定新的药物靶点【1】。这一过程的结果最终促使针对特定靶点的药物发现,如小分子调节剂或抗体等生物制剂【2】。PROTAC出现之前,药物干预的主要方式一直是靶点占位驱动的,靶点与药物特异性结合来阻断或抑制蛋白质的功能。传统的基于靶点占位作用的小分子药物主要有激酶抑制剂、受体拮抗剂或蛋白-蛋白相互作用 (PPI) 的阻断剂。这些分子同与靶标上的结合位点饱和占据起作用,通常需要与天然底物或伴侣分子竞争结合。靶标阻断虽然可以驱动药理反应,但这在机制上与基因水平研究所实现的完全敲除或清除靶蛋白不同【3】。因此,经常观察到这两种方法之间存在表型不一致。基于占位的药物仅限于靶向某个功能位点,它们还需要使结合位点完全饱和才能发挥作用,从而需要药物分子维持远高于复合物解离常数的高浓度。这反过来又对药物效力提出了更高的要求,药物效力是可观察到细胞效应的药物浓度。在体内或给患者给药时,通常需要高剂量、高频率地给药,这将影响药物的安全性,也进一步导致临床研究的高失败率【4】。2.1.1.1 降解相对于抑制的直接优势
药理学基因敲减提供了占位阻断的替代方式。反义寡核苷酸 (ASO) 和 RNA 干扰 (RNAi)已成为靶向敲减的主流方法。 然而,递送问题、较差的药代动力学特征以及有限的靶向动力学与选择性长期以来一直是这些方法的绊脚石【5】。最近,直接与靶蛋白结合来诱导靶向蛋白降解 (TPD) 的小分子降解剂的出现开启了药理学干预的新时代【6-8】。降解分子将靶蛋白、E3 泛素连接酶招募到一起,触发蛋白质泛素化和随后的蛋白酶体降解(图 2.1)。与基于占位驱动的抑制剂或拮抗剂相比,降解剂将靶蛋白同时从细胞内部被清除,更能复刻出遗传干预的表型【9】。此外,降解剂可能不需要与特定功能位点结合,可以靶向目标蛋白 (POI) 表面的任何区域,这为靶向所谓的“不可成药”蛋白质提供了机会【10】。此外,降解剂原则上可以起到催化作用,蛋白质会被蛋白酶体降解,但降解剂本身不会,理论上,每个分子都会消灭多个蛋白质分子【11】。这种催化作用体现在研究人员观察到降解剂的发挥作用浓度远低于其体外生物物理结合亲和力所预期的浓度,即亚化学剂量(图 2.1)。作为与基因敲除相比的优势,蛋白质降解是可逆和短暂的(通过蛋白质再合成),因此可用于研究胚胎致死等重要的靶点【12,13】。2.1.1.2 降解剂因其作用方式不同导致的差异
除了上述尚未验证的理论上优势,过去几年在降解剂领域的工作已经阐明了靶向蛋白质降解重要但不明显的一些优势。首先,降解剂的选择性远超人们的预期,基于其同类靶点的结合部位的固有亲和力带来的选择性,降解剂能够区分高度同源的靶蛋白,这是基于占位机制的抑制剂难以做到的【15,17-23】。其次,降解剂的活性对其靶蛋白和 E3 连接酶的二元结合亲和力的依赖程度低于单独的配体亲和力,因为降解效力不会随着结合亲和力的丧失而线性消失【15,20,23–25】。因此,对一些由于靶向非功能性结合位点或缺乏细胞效应而被临床所弃的已开发但没被利用的配体,靶向蛋白质降解为这些靶蛋白配体提供了重新开发利用的机会【9,26】。图2.1 降解剂介导蛋白质降解的作用机制及其相较基于占位的靶点阻断机制的优点。图示为Cullin环状连接酶VHL(CRL2-VHL,PDB编码5N4W)的X-射线叠加晶体结构图【14】,V CB:MZ1:BRD4 BD2复合物(PDB编码5T35)【15】和RING-ubc5a-泛素三聚体复合物(PDB编码4AP4)【16】。这些特性和机制方面的显著优势被为是降解剂的独特作用模式赋予的,其通过介导与 E3 泛素连接酶形成三元复合物起作用(图 2.1)。 结构生物学和生物物理学研究已经阐明了由三元复合物中的降解剂诱导的空间上的接近如何形成新的蛋白质-蛋白质接触面和溶剂暴露面,这些通常不会在细胞内自动发生【27】。这种相互作用的结构特征可以驱动形成高度稳定、协同性和持续性的复合物。复合物的形成反过来可以促进更有效的靶蛋白泛素化,从而以高度选择性的方式和较低的降解剂浓度更快地降解靶蛋白【9,28,29】。随着我们对降解剂活性机制理解的加深,我们将更全面的利用靶向蛋白质降解技术的显著优势。生物学家、药物化学家和药物发现工作者等都在利用这些知识来设计满足关键需求的分子,这些分子的形式可以是新的选择性化学探针,用于探测生物过程,也可以是新的差异化分子疗法。在本章中,我们将简要回顾降解剂发展历程以及近年来的突破,特别是在双功能降解剂,也称为蛋白水解靶向嵌合体 (PROTACs)方面(图 2.2)。 然后,我们将回顾驱动其作用机制的三元复合物的结构生物学和生物物理学研究的开创性进展。最后,我们阐述了一些正在开发和用于检测三元复合物形成和性质的主要分析方法,这是该领域内目前的一个热门研究分支。2.1.2 PROTACs的发展历史(2001-2010)
多年来,小分子燃起了人为诱导疾病靶点的泛素化和蛋白质降解的希望。尽管长期以来人们就知道细胞内天然蛋白质降解的机制,例如降解决定子【30】和E1-E2-E3-蛋白酶体级联反应的泛素-蛋白酶体系统(这些发现获得了2004年诺贝尔化学奖)【31-33】,但是化学家们将该系统转化出治疗获益的能力仍然很勉强。1999 年,植物激素生长素【34】和臭名昭著的药物沙利度胺【35】的作用机制被阐明之前,一种可能是双头的小分子可能将靶蛋白招募到细胞的泛素系统的理论就被提出了来并申请了专利【36】。后来,在2001年,加州理工大学的Raymond Deshaies教授和耶鲁大学的Craig Crews教授领导的研究的小组在一篇论文中发表这一想法,成为第一个体外概念验证【37】。他们开发了一种双功能分子并将其称为“PROTAC”。这个双功能分子包含一种蛋氨酸氨基肽酶 (MetAP-2) 的高亲和力共价配体卵磷脂,通过烷基聚甘氨酸连接子与衍生自 IκBα的约10个氨基酸磷酸丝氨酸多肽连接。IκBα 是Skp1-Cullin-F box复合物的天然底物,含有 F-box底物识别亚基 β-TRCP (SCF β-TRCP)【38】。PROTAC在体外泛素化测定中介导MetAP-2的泛素化,并促进了未受精非洲爪蟾卵细胞提取物中MetAP-2的降解【37】。后来的PROTAC整合了来自缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)的表位肽(图 2.2a)【39】。von Hippel-Lindau蛋白(VHL)与ElonginC和ElonginB的复合物(VCB)中,与HIF-1α多肽结合形成的复合物晶体结构为序列知识提供了信息【40,41】,其中VCB复合物构成Cullin RING E3泛素连接酶与Cullin2和Rbx1组成的复合物的一部分【14】图2.2 PROTAC技术发展里程碑。(A)早期PROTAC概念验证组成的示意图;(B)高亲和力的E3连接酶VHL(PDB编码4W9H)和CRBN(PDB编码4Cl3)的结合模式【56】。(C)2015年发表的分别由VHL和CRBN配体形成的PROTAC降解剂的图示。这些早期提供概念验证的PROTAC因其多肽成分而导致细胞活性差,限制其后续开发。泛素化和免疫共沉淀分析方法被用来揭示三元复合物的形成【42,43】,同时主要利用免疫印迹技术进行靶蛋白降解分析。然而,今天广泛应用于化学生物学和药物发现的生物物理学或结构生物学技术【44,45】在当时并没有被用于帮助评估、开发PROTACs,而仅仅用了零散表征手段对抑制作用的测定,例如 IC50【46,47】。早期PROTAC的多肽性质阻碍了它们的发展,因此靶向蛋白质降解技术的生物学应用仍然具有挑战性,更不用说将这些分子转化为药物了。当下,随着高质量E3连接酶配体开发所取得的重要进展,这些已经成为现实。2.1.3基于VHL和CRBN的PROTAC小分子(2010-2015)
高质量E3泛素连接酶配体的出现促使该领域能够设计出在细胞和体内降解效率和选择性方面都得到很大改进的分子(图 2.2 乙)。为了解决早期PROTAC多肽性质的劣势,Crews和Ciulli实验室合作开发了VHL E3连接酶的拟肽配体。羟脯氨酸是VHL对HIF-1α的关键识别组成,因此,使用羟脯氨酸作为核心结构片段,以基于片段、结构的药物设计获得了第一个类药VHL配体系列衍生物【48–50】。晶结构证实了VHL的结合模式,中心羟基脯氨酸与HIF-1α结合,其周围的化学基团紧紧地贴合在VHL表面的两个不同的口袋中,达到亚微摩尔解离常数(Kd)。这些进展为该领域接下来的工作开发第一个非肽VHL配体奠定基础。该系列基于结构的优化促进VH298分子的开发,这是一种高亲和力的选择性的(Kd=40nM)、具有细胞活性的VHL抑制剂(图2.2B)【51–53】。在另一种方法中,对臭名昭著的免疫调节药物 (IMiD) 沙利度胺作用方式的研究鉴定了Cul4 E3泛素连接酶cereblon (CRBN)为其生物学靶标【35】。沙利度胺与其类似物来那度胺和泊马度胺也被发现通过与cereblon直接相互作用靶向 CRL4 CRBN来发挥其抗癌活性【54】。IMiD与CRBN结合的共晶结构显示,配体结合在由三个色氨酸残基和一个组氨酸所组成的CRBN表面上的一个小疏水袋中(图2.2B)【55,56】。至关重要的是,IMiD可以通过将新底物蛋白“粘合”到 CRBN 表面上,起到降解剂的作用,详见第 2.2.3.1 节。这些重要的进展为利用具有良好物理化学性质的小分子与E3连接酶结合提供了可能性,因此开始与靶蛋白配体结合。2015 年,四项独立研究披露了基于VHL和CRBN的靶向BET蛋白Brd2、Brd3和Brd4以及ERRα和蛋白激酶RIPK2的PROTACs(图 2.2C)【17,57–59】。基于VHL的MZ1【17】、基于 CRBN 的 dBET1【59】和BET 的降解剂ARV-825、 【58】在癌细胞系和体内均表现出显著的降解效力和选择性。这与它们三元复合物的作用机制一致,这些 PROTAC 被证明可以在非常低的浓度下以蛋白酶体和E3连接酶依赖性方式有效地诱导可逆和持久的蛋白质降解,并且具有显著的靶标选择性【17,57– 59】。值得注意的是,Zengerle等意外地观察到BET降解剂MZ1引起的降解作用相对于同源蛋白Brd2和Brd3,对Brd4更具偏好性。这一发现是超出预期的,因为BET配体(JQ1)被用作泛BET抑制剂与所有BET溴结构域有着相近的亲和力。这是首次观察到PROTAC降解剂可使其选择性高于组成配体,这一现象目前已在该领域被大量观察到【15,17,18,20,21,60】。2015 年的研究成果是PROTAC领域的重要转折点,因为它们首次展示了小分子 PROTAC 降解剂在细胞和体内的降解范围、降解效力和广泛适用性。从那时起,该领域呈指数级增长,从每年仅发表几篇论文到每周频繁地有文章发表【7,61– 65,66】。然而,对于三元复合物如何介导PROTAC的不同活性、选择性和降解效率的理解仍然知之甚少。很明显,该领域需要更多地了解三元复合物平衡态的结构和生物物理特征以及这些特征对 PROTAC作用模式的影响。2017年,复合物晶体结构首次展示了PROTAC如何将其靶蛋白与三元复合物中的 E3 连接酶结合在一起,为进一步理解其作用模式迈出了重要的第一步,这将在第2.2.2.1 节中进行描述【15】。下一节将重点介绍有助于阐明三元复合物在 PROTAC 作用模式中的重要性的关键发现。2.2三元复合物的结构特征
要了解 PROTAC 三元复合物的结构特征,重要的是要考虑三组分、两步平衡以及定义它们的关键参数(图 2.3)。这将在下一节中更详细地描述。2.2.1 三元复合物的平衡和定义
三元复合物是通过两个独立的结合事件形成的:PROTAC与 POI-1结合组成二元复合物,随后招募POI-2 形成三元复合物。PROTAC的双功能特性意味着可以先招募POI,然后是E3连接酶,反之亦然。从系统热力学理论上讲,形成的最稳定的三元复合物的性质应该独立于该过程的发生通路(图2.3A)。因此,PROTAC三元复合物(ΔG complex) 的整体稳定性可以定义为两个连续步骤的结合自由能的总和,无论哪个POI先结合,它都应该是相同的。本章我们将主要讨论PROTAC两端的非共价结合,在POI或E3连接酶上发生共价反应的PROTAC已被报道【67-74】,此处不赘述。图2.3 PROTAC三元复合物的三体平衡。(A)形成三元复合物通过以下两个步骤:先形成一个二元复合物,再形成三元复合物。不论采取哪种途径,即PROTAC先与POI-1结合还是先与POI-2结合,总自由能变化(ΔG)即形成三元复合物的自由能变化(ΔG complex)应当相等。协同性(α)等于POI-1与PROTAC连接的Kd除以POI-1 PROTAC复合物与POI-2连接的Kd。(B)图示三元复合物的比例作为双功能分子([PROTAC])浓度的函数曲线。随着PROTAC浓度的增加,三元复合物浓度随之增加,直到平台期,并因连接酶和POI饱和导致PROTAC形成的二元复合物比例增加而引起三元复合物信号的比例衰减,即展现出“钩尾”效应。形成三元复合物数量和药理作用范围的大小受到协同性的影响。图示无协同性的PROTAC(α=1,黑线),负向协同的PROTAC(α<1,红线),正向协同的PROTAC(α>1,绿线),和有很高协同性的PROTAC(α>>1,蓝线)。PROTAC分子的一端与POI-1之间的结合过程可能受到PROTAC另一端预先结合了POI-2的影响。因此,将POI-1招募到PROTAC:POI-2二元复合物的可能比POI-1与 PROTAC形成二元复合物的可能性更大或更小都有可能,通过协同性 (α) 的参数来反映,该参数定义为二元复合物的解离常数(Kd)除以相应三元复合物结合步骤的Kd之间的比率(图2.3A)。因此,PROTAC 已经与POI-2结合时,POI-1以更高的结合亲和力结合ROTAC时,即较低的Kd时,意味着“正协同性”。正协同性或负协同性缘于三元复合体内部交叉相互作用是否有利。这种所谓的“交叉能量”在有利的情况下会为三元复合物提供额外的稳定能量,超过二元结合能的总和。协同性(α)和总稳定性(ΔG 复合物)是三元复合物平衡体的重要特征,因为它们影响三元复合物的数量和分布。作为双功能分子,PROTAC可以表现出良好的双相药理学,也被称为“钩尾效应”,二元结合可能与三元复合物形成竞争并最终超过三元复合物。这导致了一个典型的钟形曲线(图2.3B)。理论计算表明,形成正向协同和稳定的复合物预计将减轻“钩尾效应”,从而提高三元复合物相对于未结合物和二元复合物的填充程度,并扩大其形成的药理学范围【75,76】。这样的理论框架支持结构和生物物理学研究,以更详细地理解 PROTAC三元复合物平衡,这部分将在下面讨论。2.2.2 PROTAC 三元复合物的结构
基于结构的药物设计(SBDD)的经典方法聚焦于小分子和兴趣蛋白之间的二元相互作用。PROTAC与其蛋白质配体的二元亲和力很重要,因三元复合物的固有特性,如三元结合亲和力、协同性和三元复合物的稳定性也很重要。协同效应是由两种蛋白质之间有利的相互作用促成的,且PROTAC本身在复合物中采用了一种能量允许的构象。这些特征不能简单地用二元模型单独预测,因此必须将三元复合物作为一个整体进行研究。尽管计算对接程序可以成功地用于蛋白质-配体相互作用的预测(甚至蛋白质-蛋白质相互作用),但是该领域用于研究和预测PROTAC诱导的三元复合物的应用仍然处于起步阶段,尚不能达到PROTAC优化所需的分辨率和准确度【77】。因此,实验衍生的复杂结构对于深入了解PROTAC介导的三元复合物结合是至关重要的。到目前为止,蛋白质 X射线晶体学已经成为获得这种结构信息的主要技术。2.2.2.1第一个PROTAC三元复合物晶体结构:VHLMZ1: Brd4BD2
PROTAC 的作用机制需要形成三元复合物,但是三元复合物的结构特性如何对泛素化活性、降解效力以及PROTAC的选择性进行影响,仍不明确。第一个报道的PROTAC三元复合物晶体结构由Gadd等人以2.7 Å分辨率获得,包括Brd4的第二溴结构域(Brd4BD2),BET降解剂MZ1和VCB。在晶体结构中,MZ1完全被限定在电子密度内。连接子没有被拉长成线性构象,相反,它盘绕在自己周围,允许MZ1在碗状界面内呈S形构象(图2.4)。这使得VHL和Brd4BD2之间形成了一个新的蛋白-蛋白相互作用界面,这两种蛋白质在没有这种化合物的情况下不会相互作用。需要MZ1诱导的新PPI由碗状界面“核心”处的疏水相互作用组成,包括来自Brd4 BD2的“WPF架”的W374与VHL P71的堆积; 以及碗“边缘”处的氢键和盐桥相互作用,包括 VHL R107和 R108之间的盐桥拉链,一端为 Brd4BD2的 D381和E383,另一端为 VHL的R69和Brd4BD2的E438。此外,连接子被发现紧密地坐落在界面的一端,在聚乙二醇连接子中的氧和 Brd4BD2中的H437之间形成一个氢键。总表面积为2680Å2被埋藏,其中680Å2是由VHL-Brd4相互作用贡献的。图2.4 PROTACMZI在Brd4和VHL中的三元复合物的X射线晶体结构图。顶图及左下插图:VCB:MZ1:Brd4 BD2三元复合物(PDB 3T35)展示宏观的连接点【15】。右下插图:VCB:MacroPROTAC-1:Brd4BD2三元复合物(PDB 6SIS)证实macroPROTAC-1保留了MZ1的结合模式【24】。该结构不仅让我们初步了解了PROTAC如何发挥作用,而且还允许我们对观察到的MZ1的降解效力和BET亚型降解选择性得到合理解释(在第 2.1.3 节中描述)【17】。虽然 MZ与 BET溴结构域的二元结合亲和力相似,但生物物理接近性和直接结合测定表明,MZ1、VHL和BET溴结构域之间形成的三元复合物都具有不同的数量、稳定性和协同性。特别是,具有最高协同性(α = 23)和三元复合物稳定性(ΔG配合物=–22.2 kcal mol–1)的三元复合物确实与Brd4BD2成功结晶并产生结构。如此大的正协同性对应于大约2 kcal mol–1的能量,贡献了大约10%的整体复合物稳定性。至关重要的是,发现参与形成的新相互作用的许多残基在BET家族成员中并不保守。这与在BET配体结合口袋深处发现的严格保守的残基形成了鲜明对比。这一观察启发作者作出假设,同型异构体特异性新相互作用一定有助于“交叉能量”和协同性,这也正是MZ1导致的BET家族亚型选择性的原因。
协同性最好的如Brd4的C端溴结构域(BD2) (Brd4BD2)和最不协同如Brd2的N端溴结构域(BD1) (Brd2BD1) 之间鉴定出三个非保守残基,点突变实验验证了这一假设。正如预期的那样,特定的残基交换导致协同性的增强或减弱,这与诱导的蛋白-蛋白相互作用在亚型选择性招募中发挥重要作用一致【15】。对三元复杂结构的了解使该领域开始进入基于结构药物设计PROTAC的现代时代,从而能够理性设计更优化的降解剂。在第一个例子中,在晶体结构的指导下,Gadd等人假设一种新的结合配体可以被用来更好地区分三元复合物中BET蛋白质。他们随后设计了一系列新的PROTAC,其配体与VHL配体的叔丁基不同。这使得了AT1被识别出来,与MZ1相比,AT1是一种对Brd4表现出更高的选择性的降解剂,这与蛋白质印迹和无偏蛋白质组学结果一致。基于突变遗传学数据,AT1可能在VHL和Brd4BD2之间保持相同的相对取向,并且由于VHL二元亲和力损失了5倍,它优先识别与Brd2和Brd3较不协同的复合物。总之,这项工作说明了结构数据对PROTAC设计的价值,因为缺乏理性设计指导的药物化学努力可能不会轻易地发现AT1。最近,Testa等人提出假设认为可以基于MZ1三元晶体结构设计大环PROTAC,目的是“锁定”PROTAC的生物活性构象。通过计算机辅助设计MacroPROTAC-1,并通过开发定制的三官能接头合成,允许通过连接VHL配体上的酚位和邻近BET配体的酰胺键的亚甲基的新接头进行环化(图2.4)。尽管其二元结合亲和力相比Brd4BD2弱了近12倍,MacroPROTAC-1依然可以高效,快速和选择性诱导降解Brd4,其表现相当于其非循环前体MZ1。三元复合晶体结构表明,MacroPROTAC-1的结合与设计相符合,进一步验证了设计假设【24】。2.2.2.2 SMARCA2/4 PROTAC的结构指导设计
Gadd和Testa 等人的工作很好地说明了从一个已经有效的降解剂的结构开始,三元复合物的结构信息如何指导PROTAC设计。这表明在设计过程中可以采用三元晶体结构来对降解剂进行改进。Farnaby等人工作出色地证明了X 射线结构在有效驱动SWI/SNF相关,基质相关,肌动蛋白依赖性染色质调节子亚家族成员A 2(SMARCA2)和SMARCA4的有效PROTAC降解剂的设计【9】。SMARCA2和 SMARCA4是染色质BAF/PBAF复合物的ATP 酶亚基,它们在各种癌症中高度突变。BAF复合蛋白已被确定为肿瘤潜在干预靶点,例如在SMARCA4突变型肺肿瘤中SMARCA2和SMARCA4之间的综合致死关系。这两种蛋白质都含有一个高度保守的可以结合配体的溴结构域。然而,溴结构域被证明BAF ATP酶功能是非必需的,因此溴结构域抑制剂是无效的。这些发现启发Farnaby等人利用溴结构域配体开发SMARCA2/4的双功能降解剂。SMARCA2/4溴结构域的一个小分子配体在之前被Genentech和Constellation制药的团队识别出来,并被选定为靶蛋白配体【85】。与SMARCA2溴结构域(SMARCA2BD)结合的配体的复合物晶体被解析,并被是有前景的药物设计结构参考【9】。利用最近发表的已知结合模式的高亲和力VHL配体合成了少量基于VHL的PROTAC【53】。具体而言,选取含有氟-环丙基以覆盖末端叔亮氨酸基团的VHL配体 VH032【51,52】的类似物并通过酚类配体结合【18,67】,我们合成了一组由9个含有不同数量聚乙二醇(PEG)单元的连接子组成的PROTACs系列衍生物,并对其进行了表征。采用等温量热滴定法(ITC)、荧光偏振法(FP)和时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)实验(见第2.3.2节)表明PROTAC1能够在初始组合中形成最协同的(α ~ 10)和结合最紧密的三元复合物。这种正协同性补偿了在SMARCA2BD处二元结合亲和力>10倍的损失。而降解研究显示PROTAC1仅部分降解SMARCA2(大概清除65%的蛋白质)【9】。受到体外的分子相互作用惊艳的数据鼓舞,PROTAC1的三元复合物晶体结构研究也随即开展,得到2.25 Å分辨率的SMARCA2BD:PROTAC1: VCB 晶体结构(图2.5 A)。与Brd4BD2: MZ1: VCB晶体结构类似【15】,在三元复合物界面内观察到良好的PROTAC诱导的新蛋白-蛋白相互作用和蛋白-PROTAC结合。在SMARCA2BD和VHL之间诱导的蛋白间相互作用包括VHL R69与SMARCABD T1462和F1463的主链羰基之间的双齿氢键以及VHL的Y112的侧链羟基和SMARCABD N1464之间的潜在氢键。这些可能是由作用在SMARCABD T1462,F1463和N1464上的螺旋偶极子增强的。此外,SMARCABD F1463的主链羰基可与PROTAC1的VHL部分的氟环丙基形成极性相互作用。总的来说,在这个过程中,总的表面积为2330Å2,其中大约640Å2是由诱导的蛋白间相互作用PPI贡献的。与这些形成了有利的相互作用相反,聚乙二醇链形成的是不利的结合构象。根据这一观察,设计了PROTAC2,其加入一个苯环,试图在保持三元复合物的总体相对取向的同时使连接子刚性化。苯环的引入起到降低连接子极性的额外好处,同时还可以与VHL的Y98形成π堆积相互作用。PROTAC2被证明显著优于PROTAC1,可在70nM的DC50下实现SMARCA2的最大(>90%)降解,同时显示出更强的三元复合物协同性(FP的α =19)和稳定性。SMARCA2 BD: PROTAC2: VCB 三元复合物的晶体结构揭示了几乎相同的结合模式,添加的苯环准确地重现了在PROTAC1中观察到的连接子的几何形状,同时,如所预测的一样,形成了π 堆积相互作用(图2.5 B)。通过加入氧原子来扩展PROTAC2的连接子得到了比PROTAC2更好的降解剂ACBI1,以6nM的DC50就能实现>90%的SMARCA2降解。ACBI1的高选择性在蛋白质质谱组学实验进一步被验证。ACBI1在白血病细胞系和已知依赖完整BAF复合物的SMARCA4缺陷型黑色素瘤细胞系中诱导有效的抗增殖作用。ACBI1的靶向特异性细胞活性由缺失VHL、失活的cis-ACBI1和SMARCA溴化域抑制剂竞争等实验所验证【9】。本研究揭示了PROTAC形成三元复合物在药物设计过程中的至关重要的作用。特别是,结构信息可以指导连接子的快速优化,以进一步改善三元复合物的热力学参数,如协同性和稳定性。它揭示了连接子的作用不仅是连接两个结合配体,而且还产生新的分子间相互作用,导致显著增强降解活性。最终,基于结构的PROTAC设计实现了一种新的化学工具来敲低BAF复合物ATP酶,并以化学手段验证癌症中的遗传脆弱性。图2.5 基于结构的SMARCA2/4PROTACACBI-1设计【9】。在VCB中SMARCA2BD与PROTAC1(左,PDB:6HAY)或(右,PDB:6HAX),突出显示连接子优化的位点。将PROTAC1中灵活的五元链替换为苯环增加了连接子的刚性和新的潜在的VHL中PROTAC和Y98的P-P堆积相互作用。PROTAC2相较于PROTAC1,在A549细胞中显示出更强的SMARCA2降解活性。通过增加氧原子将PROTAC2连接子延长使ACBI1增强了SMARCA2的降解活性(右)。SMARCA2 BD与PROTAC ± VCB亲和力由TR-FRET测量得到。
虽然Gadd【15】,Testa【24】和Farnaby等研究团队【9】使用VHL作为E3连接酶,但CRBN作为两种单价配体(例如分子胶和双功能PROTAC降解剂)的E3连接酶也受到了关注【86,87】。2.2.2.3基于CRBN的PROTACs
Nowak等人试图解析CRBN诱导的PROTACs(dBETs)组成的三元复合物晶体结构,PROTAC分子由JQ1与沙利度胺连接而成【88】。这种dBET似乎与一些不同的BET溴结构域形成了负协同性。这些研究发现PROTACs降解活性与协同性和选择性相关,高效的降解剂形成了负协同性较低的复合物。CRBN、Brd4BD1与四种PROTACs(dBET23,dBET6,dbet70和dBET55)分别得到相应晶体复合物结构,分辨率为3.3 Å和6.3Å。正如预期的那样,dBETs的沙利度胺和JQ1部分与CRBN和Brd4BD1在其各自的二元结构中采用了相似的结合模式。该复合体中形成了2600Å2的接触表面积。在三元复合物中诱导的一些蛋白间相互作用似乎不太可能对结合自由能做多少贡献,如Brd4BD1的特异性残基Asp145 (Brd4 BD2中的Glu残基)形成的相互作用所示。这四个dBET示例的连接子长度从10个(dBE70)到34个(dBE55)原子不等,连接在Brd4口袋的不同位置。令人惊讶的是,尽管共轭点和连接子有所不同,但所有四种晶体结构具有相似的晶胞参数和整体三元结构。Nowak等人也表示观察到的三元复合物结合模式可能受到晶体堆积的影响,事实上,PROTAC结合位点上对称单元间广泛的晶体接触表明这是一个可信的结论。对晶体结构中发现三元复合物蛋白间相互作用有积极贡献的残基进行位点突变,TR-FRET测定实验表明突变降低了三元复合物形成。此外,当位于晶体结构中疏水环境中的Brd4BD1 D145被丙氨酸取代时,在相同的TR-FRET测定中观察到三元复合物形成增加。总之,这些突变研究在一定程度上证实了CRBN:dBET:Brd4晶体学所获得的复合物结构【88】。2.2.3作为单价分子胶的降解剂
2.2.3.1靶向Cereblon的免疫调节药物
曾经称为反应停的沙利度胺,最臭名昭著的致畸副作用导致了20世纪50年代超过10000名畸形儿童的出生。尽管如此,沙利度胺一直被临床用于治疗麻风病(自1998年以来)和多发性骨髓瘤(自2006年以来)【89-91】。沙利度胺及其衍生物来那度胺和泊马度胺,统称为免疫调节药物(IMiDs),他们的蛋白质靶点及作用机制直到2010年代初才被解析【35,92】。Ito研究团队发现IMiD的主要靶标是当时功能未知的蛋白质CRBN,后来进一步揭示CRBN与DNA损伤结合衔接蛋白(DDB1),Cullin-4A和Cullins-1的调节剂(Roc-1)形成复合物,并作为底物受体亚基【35,92-94】。IMiDs的生理效应被认为是通过改变CRBN的底物特异性来识别并泛素化新的蛋白质靶标,包括转录因子Ikaros和Aiolos【54,95,96】。IMiD区别于PROTAC的地方,是它们诱导蛋白质细胞内降解,但它们对这些蛋白质本身没有显著的结合亲和力,并且不含连接子的部分。由于它们能够诱导两种蛋白质相互作用,它们在历史上也被称为“分子胶”,这种分子胶类似于植物激素生长素的作用模式。生长素与植物Cullin RING连接酶底物受体TIR1结合,诱导转录阻遏蛋白IAA作为其新底物的募集、泛素化和随后的降解。在IMiD中仅来那度胺可通过诱导酪蛋白激酶1(CK1α,也是 Csnk1a1)的降解来有效治疗5q缺失相关的骨髓增生异常综合征(del-5q MDS),其中Csnk1a1是Wnt信号通路的负调节剂。由Celgen开发的CRBN 结合化合物CC-885对急性髓系白血病(AML)细胞系显示抗增殖作用,其作用归因于CC-885介导的CRBN定向降解翻译终止因子G1至S期转变蛋白1(GSPT1),GSPT1也被称为真核肽链释放因子GTP结合亚基(ERF3A)【99,100】。图2.6 CRBN-IMiD分子胶的结构特点。图中CRBN:IMiD:新底物三元复合物显示CRBN如何新底物。虽然新底物的序列缺乏同源性,但都有一个类似的β-发夹环,在相同位置上有个甘氨酸残基(红色)PDB ID:(A)6H0F【102】,(B)6H0G【102】,(C) 5FQD【101】和(D)5HXB【99】。
IMiD介导的CRBN的许多新底物,包括Ikaros、Aiolos,含有 C2H2锌指(ZF)结构域,而CK1α GSPT1都不含此结构域。X 射线晶体学和低温电子显微镜(cryo-EM)的结构生物学研究阐明了新底物的底物识别基团(图2.6)。Petzold团队解析了三元 CRBN-DDB1: 来那度胺:CK1α晶体结构,将CK1α中残基35和41之间的β-发夹环作为新底物上的主要识别元件(图2.6C)【101】。CK1α β-发夹环上的残基之一G40对于CRBN的结合是至关重要的,在该位置的突变研究证实它是结合关键残基。大约在同时期,第二个CRBN-DDB1三元晶体结构得到解析,该结构揭示CC885和GSPT1结合,含有G575的特定折叠的β-发夹环结构,类似于CK1中的关键 G40残基(图2.6D)。事实上,GSPT1中的G575与任何其他残基的取代导致CRBN亲和力的丧失。Ikaros ZF结构域所鉴定的甘氨酸残基,进一步验证了甘氨酸在IMiD依赖性CRBN底物表面转变中的重要性,当突变时,泊马度胺对CRBN的亲和力丧失【102】。Sievers团队进一步扩展CRBN iMiD介导的降解决定子的定义,使其成为更广泛的含ZF的蛋白质家族,并定义了含有CRBN:DDB1:帕马度胺的两种新的三元复合物晶体结构与含有ZF的蛋白Ikaros和ZNF692复合物(图2.6 A,B)【102】。ZF对IMiD-CRBN的特异性被证明缺乏基于序列的降解决定子,而是突出了在β-发夹环相邻区域中诱导蛋白间相互作用的重要性。2.2.3.2靶向DCAF15的磺胺类药物
小分子诱导的蛋白酶体降解可能是靶向E3 Cullin RING连接酶而不是CRBN的分子胶。已经发现芳基磺酰胺E7820,indisulam和tasisulam通过与E3连接酶DCAF15结合诱导剪接因子 RBM39的降解【103,104】。与CRBN-IMiD复合物的新底物不同,其在缺失IMiD的情况下检测不到对CRBN的结合亲和力。Du团队发现DCAF15即使在不存在芳基磺酰胺化合物(Kd~5μM)的情况下也显示对RBM39的RRM1-RRM2结构域有中等结合亲和力。通过添加磺酰胺配体如E7820,这种二元相互作用似乎大大增强,导致两种蛋白质之间的结合亲和力提高>1000倍。然而,在同一时间发表的另一项研究中,DCAF15-RBM39在没有磺酰胺配体作为分子胶的情况下,未能检测到相互作用【106】。DCAF15-E7820和 RBM39的三元结构通过X射线晶体学和冷冻电镜观察得到【105-107】。结构揭示了磺酰胺配体结合物周围的两种蛋白质之间形成了大的新作用界面,与芳基磺酰胺作为蛋白互作的增强剂一致。2.2.4 PROTAC和分子胶埋藏的表面积
降解剂介导的三元复合物结构信息突出了形成紧密相关复合物的重要性,理想情况下降解剂展现高度的协同性,从而形成相对于未结合分子或二元复合物的新相互作用。这种相互作用导致其他溶剂可及表面积(SASA)的显著埋藏,这可能有助于提高三元复合物的亲和力和稳定性。为了比较和对比SASA在不同三元复合物中的埋藏,我们使用了来自欧洲蛋白质数据库(PDBe)的蛋白质、界面、结构和组装(PISA)工具。我们比较了目前可用的PROTAC和分子胶复合物结构的蛋白质-蛋白质和蛋白质-配体界面,其结果见表2.1。靶标蛋白-E3连接酶之间的蛋白间互作的比较揭示了分子胶比PROTACs有更高的埋藏表面积的趋势(表2.1)。这可以理解为在分子胶发挥作用的情景下,降解剂或者E3连接酶均不对靶标蛋白产生高亲和力,因此分子胶的作用依赖于诱导的蛋白间互相作用,这似乎反映在分子胶结构相比PROTAC具有更高的蛋白质-蛋白质互作界面。而明显不符合该趋势的一个案例是CRBN:dBET:Brd4。首先,靶标蛋白-CRBN连接酶的蛋白互作用埋藏面积(1100 Å2)几乎是VHL复合物(~ 650 Å2)的两倍。考虑到CRBN:Brd4:PROTACs似乎是负协同性的,VHL-Brd4-PROTACs是正协同性的,这个埋藏面积也比预期的要大得多。尽管如此,这两个体系之间埋藏面积总量是可比的。由于目前可获得的三元复合物结构数量较少,无法得出有关埋藏表面积对PROTACs和分子胶降解活性影响的确切结论。随着更多三元复合结构的出现,这些趋势有望变得更加清晰。晶体结构是三元复合物的静态呈现,它可以呈现多种不同的状态,因此可能无法在所有情况下提供有关复杂过程的完整信息。因此,需要额外的生物物理学方法来扩大我们对溶液中三元复杂结构和动态特征的理解。2.3三元复合物的分析方法
了解PROTAC三元复合物的结和解离平衡和动力学对于更好地理解它们的作用模式并指导药物设计是重要的。在过去的几年里,为测定这种三元平衡的应用分析方法的研究非常活跃。在这里,我们将探讨一些已经开发出来的技术,并讨论各种检测方法可以回答的不同问题。原则上,所有的结合分析都可以同样很好地应用于研究三元复合物(POI或E3连接酶)的一种或另一种蛋白质组分;然而,在实践中,蛋白质特异性问题(例如,在测定条件下表现良好的结合分子/探针/被适当标记的蛋白可用性)可能限制可用的测定基础。此外,虽然这一部分的重点是描述PROTAC复合物的生物物理特点,在不同程度上可以或者已被用于研究分子胶系统。2.3.1我的PROTAC形成三元复合物了吗?
一旦选择了与POI和E3连接酶结合的配体并设计和合成了第一个 PROTAC,首先必须回答的问题之一是“PROTAC在多大程度上诱导三元复合物的形成?”晶体学或冷冻电镜可以明确揭示三元复合物的形成,同时阐明它们的分子结构细节(参见第2.节)。然而,获得三元复合物晶体结构的几率很低【34 34】并具有极大挑战性,因此在溶液相中验证三元复合物仍然很重要。2.3.1.1 蛋白体外亲和纯化技术(Pull-down)分析
蛋白体外亲和纯化技术分析依赖于POI-1的亲和标签,例如Flag,它提供一个标签,通过它可以从溶液中富集蛋白质,例如含有PROTAC和 POI-2的细胞裂解物。如果POI-1在亲和纯化前与三元复合体结合,则这些结合物可能会被共同分离,从而有力地表明了三元复合体的形成。在没有PROTAC或存在阴性对照化合物的情况下重复该实验,对照化合物会明显阻碍与POI-1或POI-2结合的化合物。验证亲和纯化实验结果确实是由PROTAC介导的相互作用引起是很重要的。该技术可应用于纯化的蛋白质或细胞裂解物的混合物,从而能够定性揭示PROTAC的特异性。PROTAC介导的POI和E3连接酶免疫共沉淀的例子包括基于VHL的p38降解剂、基于CRBN的【20,109】Mcl1 PROTAC【110】和招募E3连接酶DCAF16【70】或RNF【114的 BET靶向亲电PROTAC的研究【111】。这种方法特别适用于那些E3连接酶的新底物或其他配对亚基未知的分子胶【99,103,104,112】。
2.3.1.2基于接近度的三元复合物分析:AlphaScreen/LIS和TR-FRET
基于接近度的三元复合物分析利用概念上相似的机制AlphaScreen/AlphaLISA或TR-FRET等检测技术【113】。POI-1与“供体”或“受体”分子相关,而POI-2与另一个相关。当被特定波长的光照射时,供体会产生二次信号,该信号仅在受体非常接近时才能激发受体。激发的受体随后产生特征波长的荧光信号并提供读数。
供体激发受体的方法在这两种测定中有所不同:在AlphaScreen/LISA的情况下,通过激发供体产生短半衰期的单线态氧物质并继续激发受体;相反,FRET在合适荧光团之间产生不同的波长。两种检测都对接近度高度敏感。因此,只有当供体和受体在短距离内结合时才会观察到强信号,例如在三元复合物中结合时(图 2.7,顶部)。PROTAC的一系列滴定通常会导致信号随着PROTAC浓度的增加而增加,直到达到最大值,之后信号将再次下降。高浓度PROTAC的信号下降(图 2.7,底部)是由于钩尾效应引起(参见第 2.2.1节)。由于峰强度和浓度受多种因素影响,接近度分析只能提供三元复合物的半定量读数。特别是在AlphaScreen/LISA的情况下,具有多个衍生位点的基于微珠的设置可能会以不可预测的方式影响信号强度。无论如何,基于接近度的测定是迄今为止应用于研 PROTAC三元复合物的技术中通量最高的,每次实验只需要非常少量的蛋白质。图2.7 基于接近度的三元复合物检测原理。上图:AlphaScreen/LISA模式图。当供体和受体的微粒距离很近时,例如处于PROTAC介导的三元结构中时,特征性波长(520-620nm)的荧光发射被放大。下图:反应特征性钩尾效应的具有代表性的AlphaScreen/LISA曲线。Gadd团队使用了AlphaLISA接近度分析。作为初始结合的筛选,解决了VHL、基于MZ的 PROTAC库和BET溴结构域之间形成的三元复合物谱的明显差异,尽管这些结构域与那些相同溴域具有高度相似的二元亲和力【15】。Alpha分析也已用于检测基于CRBN的BET-PROTAC三元复合物的形成【59,114,115】,PROTAC针对其他溴结构域蛋白质如Brd7/9【19,116】、TRIM【24,26】 SMARCA2/4【9】、蛋白激酶【20,109】和Bcl-2/Bcl-xL【117】。AlphaLISA已被用于证明使用基于VHL的同型PROTAC在体外重组VHL的二聚化【18】。AlphaLISA检测还用于监测细胞裂解物中SMARCA2/4-PROTACs三元复合物的形成【9】。 TR-FRET检测已被广泛用于表征IMiD对新底物被CRBN招募的差异特征、基于IMiD的PROTAC【88,118】以及最近的DCAF15、磺胺胶配体和RBM39之间三元复合物的形成【105-107,119】,和基于 VHL 的靶向EED PROTAC【120】。
2.3.1.3表面等离激元共振
表面等离激元共振(SPR)是另一种通用的生物物理方法,能够直接观察二元和三元复合物的形成【44】。SPR芯片是通过POI-1固定在含通道的金箔芯片表面而衍生的。POI-1的固定对于SPR结合试验的成功至关重要,因此必须努力使固定蛋白的活性和结合能力最大化。直接固定是优选的,或者通过氨基偶联(这可能导致POI-1方向的异质性)或通过POI-1上单个位点(例如 N-末端)的亲和标签或生物素标签,从而得到更均质的表面。然后将含有PROTAC或与等摩尔或过量POI-2预孵育的PROTAC溶液流过芯片表面。观察到的信号强度与芯片表面密度的增加成正比,从而可以区分PROTAC单独结合形成二元复合物和PROTAC+POI-2与芯片表面上的POI-1形成三元复合物(图 2.8)。该实验的设置意味着只有固定在芯片的蛋白质需要亲和标签,而POI-2无需标签。此外,一旦固定,POI-1表面通常可以针对不同PROTAC、POI-2蛋白及其组合的文库多次重复使用。图2.8 二级和三级SPR实验模式图。POI-1以特定密度被固定于某个表面。当PROTAC流过POI-1时,二级结合使得表面密度(红色箭头)相对POI-1密度出现小幅增加,并出现较低的最大反应值(Rmax)。当引入POI-2+PROTAC并形成三元复合物时,可得到相对较大的表面密度增加(绿色箭头)并出现更高的最大反应值(Rmax)。图示为分别进行PROTAC和PROTAC+POI-2进样时的结合特征图(分别对应下图左、右)。SPR通常用于二元复合物的分析,自Roy团队首次利用SPR在三元复合物研究之后迅速流行起来【28】(详见第2.3.4节)。迄今为止SPR是PROTAC应用中独特的生物物理技术,因为它能够实时定量测量所研究的复合物的结合和解离。基于SPR提供的动力学数据对PROTAC项目的方向优化至关重要,本章后面将更详细地讨论。该技术的实时动力学测量既是其优点但也限制了其使用,由于PROTAC解离的时间跨度,特别是对于高亲和力的PROTAC和三元复合物其解离时间会变得相当长从而降低SPR的通量【28,121】。由于单循环动力学实验只需要测量每个分析物浓度系列重复的单一解离曲线,与更传统的多循环动力学方法相比,这种方法可以大大提高通量。实验推导的单循环动力SPR轨迹的例子如图2.12所示。在较新的,高度并行的SPR仪器也可以帮助增加检测循环,但通量不可避免地落后于基于接近度的检测。非变性纳米电喷雾电离质谱法最近被Beveridge团队证明是一种有望在自然游离条件下检测三元复合物的半定量方法【122】。这种无标记技术可以在一次测量中检测和区分多种结合价态和结合分子,甚至可以检测低丰度物质。质谱法这些特征可能有利于在体外研究或作为后续检测方法验证免疫沉淀亲和纯化分析中提取的三元复合物的后续方法的效果。2.3.2 我的三元复合物结合的多紧?
越来越丰富的生物物理技术工具可用于定量评估PROTAC 在三元复合物组装中的亲和力。这些检测可大致分为“直接”和“竞争”结合试验。如第 2.2.1节所述,这些技术可以解析相互作用的Kd,因此解析二元或三元相互作用的ΔG ,从而得出复合物形成的总ΔG。2.3.2.1 竞争试验
竞争分析利用测试替代分子对PROTAC或PROTAC + POI-2 响应POI-1,从而导致信号发生变化。替代分子基于与POI-1的结合配体(例如,小分子、肽、结合蛋白)产生相同的标签信号,具体取决于测定方法。AlphaScreen/LISA和TR-FRET可用于如第2.3.1.3节所述的三元复合接近度模式,或用作基于竞争的结合测定。在竞争形式中,供体与POI-1偶联,受体与POI-1配体偶联(反之亦然)。PROTAC或 PROTAC+POI-2与POI-1配体竞争,POI-1:PROTAC 或 POI-1:PROTAC:POI-2 复合物形成从而引起信号减少(图 2.9A)。因此,这种竞争模式允许在并行测定中测量二元和三元的结合。该测定可以用于比较二元结合或三元结合的Kd,从而测量基于VHL靶向SMARCA2/4溴结构域的PROTAC的协同性【9】,并测量IMiD和新底物与CRBN的结合【102,123 102,123】。竞争性FP检测可以用于研究无需标记POI或连接酶的PROTAC系统。在FP实验中,在增加PROTAC或PROTAC + POI-2的浓度时,可以测量与POI-1结合的小分子探针的置换。小分子探针包含荧光,在溶液中处于游离态时可使水平偏振光去偏振,但在与POI-1结合时保持偏振【44】。通过测量垂直于入射光方向发射光的强度,可以得到探针与POI结合置换的预估比例(图2.9B)。竞争分析通常是高通量的,但对可能阻碍PROTAC之间直接比较的特定环境混杂问题的影响也更敏感,如化合物显示出高固有吸光度或其他不需要的特性(如荧光或单线态氧猝灭)时。在POI-不存在或存在的情况下,通过 PROTAC观察滴定曲线的左移或右移检测POI-1配体的位移可揭示其协同性,因此POI-2的存在会影响平衡(图 2.10)。竞争分析不受钩尾效应的影响,与三元接近度分析相比,该方法可以对结合进行更多的定量评估。最近的几项研究表明,使用FP检测可以来监测二元和三元复合物形成,从而测量 PROTAC的协同性【9,28】图2.9 竞争分析模式图。(A)基于AlphaScreen的竞争分析测量了,用PROTAC或PROTAC+POI-2将POI-1从结合体中移除时的信号下降。(B)在FP分析中,当荧光探针被PROTAC或PROTAC+POI-2从POI-1中移除时,检测到水平偏振光偏移增加。图2.10 竞争性三元复合物测定的剂量-反应曲线。FP曲线示意图测量荧光探针从POI-1到PROTAC(黑色虚线)或PROTAC:POI-2复合物的位移,分别为正协同(绿色)、无协同(青色)或负协同(红色)的情况。2.3.2.2 直接结合试验
三元接近度分析,如先前讨论的AlphaScreen/LISA和TR-FRET产生的三元复合物形成的读数。由于仅当POI和E3连接酶非常接近时才能获得高信号,这些方法对于获得三元复合亲和力数据很有吸引力,但不能报告二元亲和力。因此,结合分析是直接测量二元和三元亲和力的首选方法。SPR是测定这些的稳健方法。另一种测量直接结合的完全无标记的金标准方法就是等温量热滴定法(ITC)。通过测量含有一种结合配体的溶液滴定到另一种时的温度变化,ITC能够准确地确定结合化学计量(N)、Kd和焓变化(ΔH)(图 2.11)。由于结合自由能变化(ΔG)可以由Kd计算得到,也可以间接测量复合物形成的熵变(ΔS)【44】。有研究PROTAC三元复合物专门应用ITC的报道【15】。ITC研究蛋白质-配体相互作用的一般操作是将注射器中的小分子溶液滴定到样本蛋白质溶液中,虽然这种方法仅可以用于研究PROTAC与任一POI的二元结合,但由于“钩尾效应”,该方法不适合应用于三元复合物。为了绕过这一限制,Gadd团对建立了一种顺序“反向滴定”方法【15】。这涉及首先将POI-1滴定到PROTAC中(图2.11A),然后将POI-2滴定到形成的二元复合物POI-1:PROTAC的样本中。通过确保PROTAC在第一次滴定(或单独的样品制备)结束时被POI-1完全饱和,消除了由于钩尾效应引起的任何潜在问题。由于POI-1和POI-2在没有PROTAC结合的情况下通常不会有亲和力相互作用,因此相对于PROTAC,样品池内任何化学计量过量的POI-1预计不会对第二次滴定期间测量的热信号产生影响,因此确保在该过程中仅监测三元复合物的形成。这种方法允许研究者确定二元及三元PROTAC复合物的热力学变化曲线。通过比较POI-1滴定POI-2:PROTAC的ITC曲线(图 2.11B)与POI-1单独滴定PROTAC的曲线(图2.11A),可以很快获得PROTAC三元复合系统的协同性。此外,将连续结合过程的自由能加起来(ΔG1+ΔG2,或ΔG3+ΔG4),可计算PROTAC三元复合物的稳定性。因此,ITC可以让研究者明确PROTAC三元复合物完整的平衡热力学曲线。该方法已用于表征基于VHL靶向BET蛋白Brd2、Brd3和Brd4【15,23,24,124】、Brd9【116】、SMARCA2【9】的PROTAC、以及被自诱导降解PROTAC形成的VHL二聚体【18】。ITC是一种不需要对蛋白质或PROTAC进行任何标记的可以用于验证PROTAC系统或更普遍的任何生物分子相互作用系统的金标准技术。然而,作为一种通量有限的,特别是需要高纯度蛋白质的技术,ITC往往更适合于对较少感兴趣的系统进行高质量表征,而不适合作为初步筛选分析的工具。除三元接近度分析外,本节中概述的所有其他生物物理学技术都可用于确定PROTAC与其一个蛋白质结合的亲和力。因此,这些二元和三元亲和力实验的对比分析结果提供了非常有价值的信息,可以揭示PROTAC三元复合物的相对协同性和稳定性。图2.11 通过反向滴定ITC监测二元和三元复合物并测量协同性的实验结果。(A)仅将POI-1滴定至PROTAC;(B)在存在饱和浓度的POI-2的情况下,将POI-2滴定入PROTAC中。饱和POI-2的样品可从将POI-2滴定入PROTAC中得到,或将PROTAC和POI-2按轻度过量配比预混得到。从这些滴定中,可测量得到下述复合物形成的参数:配比(N),结合常数Ka,并由Ka可计算得到Kd和ΔG;结合热ΔH,通过ΔH可计算得到结合熵变ΔS。二元和三元的Kd比值可确定协同性α的值。数据由邓迪大学的Michael Roy博士收集。2.3.3 我的三元复合物协同性如何?
在三元复合物中会出现分子间相互作用,不仅在PROTAC和靶蛋白之间,靶蛋白和E3连接酶之间也会存在全新的蛋白间相互作用。因此,协同性的PROTAC可以超过其配体自身结合力。此外,蛋白间相互作用对新界面上的大量残基具有高度特异性,从而提升了降解特定靶蛋白异构体或区分相近的亚型或突变体的可能性【15,99,101】。这些特征意味着增强协同性和三元复合物稳定性与提高PROTAC特异性和降解效力之间通常存在紧密的相关性,突出了这些作为重要优化参数的重要性【9】。我们经常观察到这样的情况,PROTAC与其靶蛋白的二元亲和力的不足通过协同性得到弥补【9,15,23,24】。
为了获得最具可比性的结果,理想情况下应在同一分析方法中确定特定PROTAC系统的协同性,并通过正交分析确认。在二元和三元模型中,那些可以在存在或不存在POI-2的情况下测量PROTAC与POI-1的结合的分析方法,可用于确定协同性。例如,来自FP竞争实验的示意图示于图2.10 中,显示了由PROTAC诱导的正、负和非协同三元复合物引起的结合曲线的变化。
2.3.4 我的三元复合体能持续多久?
PROTAC三元复合体的研究表明,长寿命、更稳定的三元复合物由于目标蛋白泛素化程度更高,从而促进目标降解速度更快【9,28】。这凸显了拥有可靠工具来探PROTAC 三元复合物解离动力学的重要性【28,29】。SPR的独特之处是它SPR的独特之处在于它能够从三元复合物亲和试验中获得结合解离参数,从而为所研究体系提供了重要的动力学信息。Roy团队在对BET降解剂SPR研究揭示了测量三元复合物半衰期以探测 PROTAC特异性的价值【28】。PROTAC-MZ1被作为模型系统进行研究。MZ1先前已显示优先诱导Brd4的降解(在第2.1.3节中描述)【15,17】。为了进一步研究MZ1三元复合物,作者设计了一种位于ElonginB的C端生物素标记的VCB(生物素-VCB)载体,并将其固定在负载链霉亲和素的SPR芯片上。进行包含生物素-VCB、MZ1和Brd2、Brd3和Brd4的BD1或BD2的三元复合物的半衰期的SPR比较实验,实验表明每种BET蛋白的BD1形成的复合物寿命相较BD2短得多(t1/ 2<1s)【28】。值得注意的是,含有Brd2 BD2和Brd4 BD2的三元复合物的稳定性(t1/ 2分别为70s和130 s)远高于VCB:MZ1: Brd3 BD2三元复合物(t 1/ 2 = 6 s)。在存在饱和浓度的Brd3 BD2或Brd4 BD2的情况下,MZ1与VCB结合的代表性单循环SPR曲线如图2.12所示。与Brd3相比,发现这与Brd4(和Brd2)的蛋白酶体降解的更高初始速率相关【28,29】。VCB : MZ1 : Brd4BD2复合物的晶体结构表明观察到的三元复合物稳定性差异可以通过溴结构域之间的单个氨基酸差异来解释(Brd3 BD2中的E344;Brd2 BD2和Brd4 BD2中的G382或G386)。这些观察结果通过在Brd3BD2 (E344→G) 和Brd4 BD2 (G386→E)的定点突变研究得到验证,对所得VCB: MZ1: 溴结构域SPR动力学曲线进行分析。与所预期的相同,这些氨基酸突变体导致三元复合物亲和力的反转,与天然变体相比较,Brd3 BD2 E344G复合物存在时间较长(t1/2 = 59s),而Brd4 BD2,G386寿命较短(t1/2 = 3.5s) 【28】。Pillow团队发表了另一个PROTACs三元复合物动力学案例。在分析GNE-987时,Brd4是一种皮摩级别的选择性降解剂。SPR显示GNE-987与Brd4 BD1形成三元复合物的t1/2约为4000秒,相当于>1小时的半衰期,这可能是其出色的降解效力的基础【121】。SPR并不是唯一可用于检测结合动力学的生物物理技术,双分子层干涉法(BLI)也是一种适合的技术。BLI已被应用于测量分子胶的二元亲和力【105】。据我们所知,PROTAC中尚未探索可通过该技术获得解离动力学。2.3.5 PROTAC是否诱导细胞中三元复合物的形成?
重组蛋白或割裂的结构域的生物物理研究在多大程度上真实地反映细胞行为?例如,在多亚基复合物中一部分蛋白的研究中,需要进一步实验验证。由于第一层关键蛋白间互作是在PROTAC结合位点周围形成的,研究配体结合结构域是应该首先考虑的【9,15,24】。但研究也观察到了一些例外,例如,Khan团队开发了一种基于Bcl-2/Bcl-xL抑制剂ABT263的VHL介导的PROTAC(DT2216),并发现它在活细胞的NanoBRET三元复合物测定中,对Bcl-xL的选择性高于Bcl-2,其优先形成VHL:DT2216:Bcl-xL三元复合物的结果,优于相应的VHL:DT2216:Bcl-2【117】。这似乎与检测到存在与两种靶蛋白的三元复合物的重组蛋白中AlphaLISA实验结果不一致。
图2.12 单循环三元复合SPR。 来自SA芯片固定化生物素VCB (~1000 RU)的实时动力学轨迹。(A)在Brd3 BD2或(B) Brd4 BD2 的饱和浓度存在下,MZ1以0.8、4、20、100和500 nM浓度流过芯片。SPR曲线显示,MZ1在生物素-VCB和Brd4BD2之间(t1/2 = 130s,Kd = 1nM)比在生物素-VCB和Brd3BD2之间(t1/2 = 6s,Kd= 8nm)形成了更稳定的复合物。单循环数据与更传统的多循环数据的不同之处在于,后一次的进样是在预结合物质完全解离之前进行的。数据由邓迪大学的 Michael Roy博士收集。基于细胞的实验对于验证活细胞中的靶蛋白活动非常重要,并且可以进一步应用于检测活细胞中的三元复合物形成、靶蛋白泛素化和靶蛋白实时降解【29】。最近报道的两种基于细胞的试验方法为生理条件下研究三元复合物的形成提供更多可能,这两种技术分别是基于SPPIER(separation of phases-based protein interaction reporter)和生物发光共振能量转移(BRET)的分离【29,125】。2.3.5.1 基于相变的蛋白质相互作用报告响应分离(SPPIER) 技术
荧光成像可用于检测细胞中由小分子(包括PROTAC和分子胶)诱导的蛋白质-蛋白质相互作用。为了实现这一目标,Chung 团队通过重新利用他们之前的研究蛋白激酶的方法,开发了一种他们称之为SPPIER的技术【125、126】。建立SPPIER分析始于POI-1与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合表达,EGFP又与30个氨基酸的同源寡聚标签(HO-Tag)3融合。同样地,构建包含POI-2、EGFP和33个氨基酸HO-Tag6的融合蛋白,并制备能够过表达这两种融合蛋白的细胞系。在溶液中,HO-Tag3和HO-Tag6分别形成六聚体和四聚体复合物。添加PROTAC后,POI-1和POI-2形成三元复合物,由于HO-Tags引入的多价性,诱导POI-EGFP-HO-Tag蛋白相变快速改变形成致密液滴并最终通过荧光细胞成像技术可以观察到荧光蛋白【125】。这种配体诱导的相变的可逆性意味着洗掉PROTAC可以观察液滴的消散。2.3.5.2 生物发光共振能量转移(BRET)技术
NanoBRET是Promega公司开发的检测技术,NanoBRET实验需要用一个含11个氨基酸的“HiBiT肽”标记POI-1,当它与18 kDa LgBiT蛋白共表达时,自发形成NanoBiT萤光素酶【127】。还需要使用水解酶“Halo”蛋白标记POI-2。萤光素酶充当能量供体,而Halo标签与单独添加的底物结合时充当能量受体,三元复合物的形成使得供体和受体接近时会产生发光信号【128】。细胞水平的nanoBRET/nanoBIT技术已应用于研究基于VHL的Brd7/9降解剂VZ185【116】、Bcl-2/Bcl-xL的降解剂DT2216【117】和基于CRBN的Cdk4/6降解剂【129】。细胞实验受到标签、靶蛋白和E3连接酶的要求限制。由于化合物的细胞膜通透性和细胞内稳定性等潜在限制因素的干扰,将三元复合物的热力学和动力学特征精确量化到生理条件所需的精度仍然是一个挑战。因此,拥有一系列稳健的定量测定法来测量体外PROTAC与重组蛋白三元复合物的生物物理相互作用仍然是至关重要的,这样可以控制测定组分的纯度和浓度。2.4 结语
本章概述了一些形成性的想法和开创性的概念验证实验,它们为早期的靶向蛋白质降解研究铺平了道路。高亲和力E3连接酶配体的发现显著提高了这种极具潜力新模式的可行性,触发了研究者们对该领域的爆炸式增长的兴趣。PROTACs和分子胶的三元复合物实验首先阐明了那些难以预测的全新的蛋白质-蛋白质相互作用,开辟了使用SBDD优化这些小分子蛋白质降解剂的可能性。最后,我们盘点了目前研究人员正在使用的最前沿、不断发展的生物物理技术,梳理决定降解复合物作用模式的结合事件的复杂性。总之,这些分子结构研究技术代表了指导设计和改进降解剂的强大工具,从而促进这些降解剂能够以新型小分子探针的形式推动蛋白质功能研究的新方法。当我们学会将PROTAC转化为药物时,我们可能最终有机会清除一系列被传统药物研发领域视为“不可成药”的关键靶蛋白。2.5 致谢
我们感谢许多同事、合作者和实验室成员多年来提供的宝贵意见和讨论。我们感谢Will Farnaby对本手稿的建议。由于篇幅限制,我们向许多无法引用的文章的作者致歉。2.5.1 基金
Ciulli实验室在针对E3连接酶的小分子和PROTAC的工作已获得欧洲研究委员会(ERC)在欧盟第七框架计划(FP7/2007-2013)下的资助,作为对A.C.的启动资助(赠款协议编号ERC-2012-StG-311460 DrugE3CRLs)。Ciulli实验室正收到或已经收到Amphista Therapeutics、Boehringer Ingelheim、Eisai、Nurix和Ono Pharmaceuticals的研究赞助支持。2.5.2 利益冲突声明
A.C.是Amphista Therapeutics的科学创始人、股东、非执行董事和顾问,该公司正在开发靶向蛋白质降解治疗平台。其余作者声明不存在利益冲突。注:为了提高可读性,没有列出具体参考文献,需要的读者请参考原文reference.