一、研究对象
选取2020年11月至2021年12月于苏州大学附属第一医院内分泌科住院的新诊断的T2DM患者作为研究对象。纳入标准:(1)T2DM诊断依据1999年世界卫生组织糖尿病诊断标准[6];(2)1年之内明确诊断T2DM,且未予任何降糖药物治疗的T2DM患者。排除标准:糖尿病合并急性并发症、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤、近期有激素类药物使用史、自身免疫性疾病,甲状腺功能亢进/减退等其他内分泌疾病患者,妊娠期妇女。并选取同时期体检中心无糖尿病的健康志愿者作为正常对照组。本研究获得苏州大学附属第一医院伦理委员会批准(批文号2022180),所有研究对象均阅读并签署知情同意书。
二、研究方法
1.一般资料收集:详细询问并记录所有研究对象性别、年龄,测量研究对象身高、体重并计算其体重指数(body mass index,BMI)。
2.临床生化指标检测:研究对象均禁食12 h,次日晨测量血压后采集空腹静脉血,收集研究对象空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、尿酸和超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)等(日本,Hitachi公司,7600),采用高效液相色谱法(日本,Tosoh公司,HLC-723G8)检测糖化血红蛋白(glycated hemoglobin A1c,HbA1c)。
3.T2DM患者空腹静脉血采集后,行100 g馒头餐试验,餐后分次采集0.5、1、2、3 h静脉血。采用电化学发光免疫分析法(日本,Tosoh公司,AIA-2000ST)检测空腹胰岛素(fasting serum insulin,FINS)和空腹C肽(fasting C-peptide,FCP)、0.5 h胰岛素(INS0.5h)和0.5 h C肽(CP0.5h)、1 h胰岛素(INS1h)和1 h C肽(CP1h),2 h胰岛素(INS2h)和2 h C肽(CP2h),3 h胰岛素(INS3h)和3 h C肽(CP3h)。计算血清胰岛素和C肽曲线下面积(area under curve,AUC),即AUCINS和AUCCP:AUCINS=FINS/2+INS0.5h+INS1h+INS2h+INS3h/2;AUCCP=FCP/2+CP0.5h+CP1h+CP2h+CP3h/2。采用稳态模型评估胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)评估IR程度:HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。
4.采集T2DM患者和健康志愿者外周血5 ml,用Ficoll分离液(中国,达优公司)分离外周血获得外周血单个细胞群,加入磷酸盐缓冲液洗涤后取3×105个细胞置于试验管中,分别加入4 μl以下抗体:抗CD4-BV605荧光、抗-CD25-BV421荧光、抗-程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD1)-FITC荧光、抗-OX40-Percpcy5.5荧光(美国,BD公司)、抗-CXC趋化因子受体5(C-X-C chemokine receptor type 5,CXCR5)-APC荧光(美国,eBioscience公司)、抗-CD127-PECy7荧光(美国,Biolegend公司)。同时设置单标管,混匀,4 ℃避光反应30 min,洗涤离心后磷酸盐缓冲液重悬后上流式细胞仪(美国,Beckman Coulter,CytoFLEX S)检测外周血中CD4+CD25-CD127+CXCR5+PD1+Tfh细胞比例及其表面OX40的表达。
三、统计学方法
采用SPSS 22.0软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料以表示,两组间比较采用t检验。非正态分布的计量资料以M(Q1,Q3)表示,经对数变化为符合正态分布的变量后行t检验。计数资料采用例(%)表示,组间比较采用χ2检验。采用Pearson相关分析法分析HOMA-IR与各临床指标的相关性。采用多重线性回归分析法分析HOMA-IR的影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。
一、两组研究对象基线资料的比较
共纳入160例研究对象。其中,T2DM组96例,对照组64名。与对照组相比,T2DM组的BMI、TC、TG、LDL-C、尿酸、FPG和HbA1c均更高,差异具有统计学意义(P<0.05,表1)。
二、两组研究对象cTfh细胞表面OX40表达的比较
流式细胞术检测外周血CD4+CD25-CD127+PD1+CXCR5+Tfh细胞表面OX40的表达,检测结果显示,与对照组相比,T2DM组OX40+Tfh细胞比例升高,分别为(3.95±1.62)%和(7.51±5.32)%,差异具有统计学意义(t=4.29,P=0.006)。
三、胰岛素抵抗指数与相关指标的相关性分析
Pearson相关分析结果显示,HOMA-IR与BMI(r=0.450)、AUCINS(r=0.341)和OX40+Tfh细胞比例(r=0.569)均呈正相关(P<0.001,图1),与年龄、收缩压、TC、TG、LDL-C、HDL-C、尿酸、FPG、HbA1c和AUCCP无相关性(P>0.05)。
图1 96例新诊断T2DM患者胰岛素抵抗指数HOMA-IR与BMI、AUCINS和OX40+Tfh细胞比例的相关性曲线
四、新诊断T2DM患者IR影响因素的多重线性回归分析
以HOMA-IR指数作为因变量,经过多重共线性诊断和筛选(方差膨胀因子>5认为存在多重共线性),选取年龄、BMI、HbA1c、TG、LDL-C、尿酸、AUCINS、OX40+Tfh细胞比例值为自变量进行多重线性回归分析。结果显示,OX40+Tfh细胞比例(B=0.284,95%CI 0.029~0.538,P=0.017)、BMI(B=0.249,95%CI 0.030~0.486,P=0.022)增加均可对新诊断T2DM患者IR程度造成独立的正向影响(表2)。
IR主要表现为患者外周组织和靶器官对胰岛素敏感性和反应性下降,进而导致周围组织摄取和利用葡萄糖效能受损[7]。机体为维持血糖稳定代偿性分泌过量胰岛素,最终导致T2DM、代谢综合征等疾病的发生。目前,主要应用HOMA-IR评估IR水平。1995年,Grell等[8]首次报道肥胖个体脂肪组织中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)表达增加参与IR的发生。近年来,越来越多的研究人员将关注点聚焦于慢性免疫炎症和IR的关系研究。发生IR的个体外周循环中肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素-1β等促炎因子的增加诱导胰岛素受体底物的丝氨酸/苏氨酸磷酸化,阻碍络氨酸磷酸化,导致胰岛素受体底物和胰岛素受体的结合能力下调,减弱胰岛素受体底物激活其下游丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化水平,从而影响脂肪、肝脏和肌肉组织中胰岛素信号传导[9]。
Tfh细胞是一类新型CD4+T细胞亚群,分泌促炎因子白细胞介素21,促进Tfh细胞自身分化的同时诱导B细胞分化为浆细胞,形成炎症生发中心[10]。Morita等[11]提出外周血中高表达CXCR5的CD4+T细胞是淋巴滤泡中Tfh细胞的功能对应产物,命名为cTfh细胞;在1型糖尿病、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病患者外周血中均可检测到比例异常增多的活化cTfh细胞,其数量和疾病严重程度呈正相关,提示这群cTfh细胞异常的免疫应答参与了疾病的病理进程。Taghavie-Moghadam等[12]在动物实验中观察到信号传导及转录激活因子-4依赖促进Tfh细胞的免疫效应参与小鼠IR和动脉粥样硬化的病理过程。Zhou等[13]研究报道在非肥胖T2DM患者肠道黏膜组织中CD4+CXCR5+Tfh细胞和γ干扰素比例上调,在肠道免疫炎症中发挥重要作用。Wang等[14]研究发现,与健康对照者相比,T2DM患者cTfh细胞比例显著升高,且其在合并腹部肥胖的患者中升高明显。潘畅等[15]报道在老年T2DM患者中cTfh细胞水平高于对照组,升高的cTfh细胞比例加剧细胞和体液免疫调节紊乱,导致IR和胰岛功能受损的发生。以上研究均观察到在T2DM患者外周血中cTfh细胞亚群比例升高,提示此亚群细胞可能在T2DM患者的IR发生中扮演重要角色。
OX40/OX40L是TNFR/TNF超家族成员,介导正性刺激信号,是调节Tfh细胞分化的重要的共刺激分子,高表达OX40促进OX40/OX40L信号增强放大Tfh细胞免疫应答效应。Liu等[16]在动物实验中发现高表达OX40的T细胞参与了高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织慢性低度炎症,且较正常小鼠,OX40基因敲除小鼠的体重增加和FPG水平的降低程度均更显著,提示OX40、肥胖相关的脂肪炎症和IR密切相关。有文献报道,Rouqin蛋白通过抑制可诱导共刺激分子和OX40 mRNA的表达调控Tfh细胞分化[17],提示OX40与Tfh细胞之间存在一定的关联。进一步研究表明,OX40缺陷小鼠感染淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒后Tfh细胞数量下降、生发中心以及浆细胞也明显减少[18]。Jacquemin等[19]对系统性红斑狼疮的研究显示,表达OX40L的CD11c+抗原提呈细胞的增加导致OX40信号增强,进而通过增强T细胞抗原受体信号放大Tfh细胞应答,并发现OX40信号可以上调CD4+T细胞上CXCR5、PD-1和Bcl-6的表达,促进其分化为Tfh细胞。因此,OX40信号在促进人Tfh细胞分化和增殖发挥重要作用。然而目前有关OX40+Tfh细胞亚群和T2DM的相关性研究却较少。本研究选取新诊断T2DM患者作为观察对象,发现较健康志愿者,T2DM患者外周血OX40+Tfh细胞比例升高,相关分析发现HOMA-IR与OX40+Tfh细胞比例呈正相关;继续以HOMA-IR作为因变量开展多因素线性回归的分析发现,OX40+Tfh细胞比例的增加对新诊断T2DM患者IR程度造成独立的正向影响。因此,我们猜测OX40+Tfh细胞比例增多可能是影响新诊断T2DM患者IR的独立危险因素,提示OX40参与放大的Tfh免疫效应在T2DM发生IR过程中发挥重要作用。
本研究结果亦发现,HOMA-IR与BMI、AUCINS呈正相关,且BMI亦是HOMA-IR的危险因素,与既往研究结果一致[20],提示肥胖和超重是引起T2DM发生IR的重要影响因素。因此,减轻体重亦是改善新诊断T2DM患者IR的重要手段。
尽管经过严格的课题设计,本研究亦存在不足:第一,本研究样本量较少,课题组将在此基础上扩大样本量深入探索其潜在的意义;第二,本研究尚无法判断OX40+Tfh细胞增加和T2DM患者发生IR之间的因果关系,后续研究中仍需要更多前瞻性研究进一步证实。
综上,本研究探索了新诊断T2DM患者发生IR的影响因素,发现OX40+Tfh细胞亚群比例可能是新诊断T2DM患者发生IR的独立危险因素,Tfh参与的免疫炎症在新诊断T2DM患者发生IR过程中发挥重要作用。本课题组将继续应用sOX40蛋白/阻断型抗-OX40L mAb干预OX40/OX40L信号深入探索其参与Tfh免疫效应及其在IR发生发展过程中的免疫病理机制,为临床工作中改善IR提供新的治疗思路和策略。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
参考文献略
来源:中华糖尿病杂志微信公众号